碘乙酰胺

碘乙酰胺相關(guān)實驗：

1蛋白質(zhì)的N端測序  Edman降解法：Edman降解進行蛋白質(zhì)與多肽序列分析是一個循環(huán)式的化學(xué)反應(yīng)過程。包括三個主要的化學(xué)步驟：（1）偶聯(lián)：異硫氰酸苯脂與蛋白質(zhì)和多肽的N-端殘基反應(yīng)；（2）環(huán)化裂解：苯氨基硫甲酰酞（PTC-肽）環(huán)化裂解；（3）轉(zhuǎn)化：噻唑呤酮苯氨（ATZ）轉(zhuǎn)化為苯異硫尿氨基酸（PTH-氨基酸）；為了提高靈敏度，一是采用放射性同位素、熒光基團或有色Edman試劑, 二是采用更靈敏的鑒定手段, 如用微量薄層層析、氣相色譜和高壓液相色譜檢出PTH氨基酸。蛋白質(zhì)的液相測序儀、固相測序儀和氣相測序儀的原理都是Edman降解法。此法不能用于N端封閉的蛋白質(zhì)的測序。

2蛋白質(zhì)的C端測序  

（1）羧肽酶法：羧肽酶法的原理就是通過檢測羧肽酶逐個釋放氨基酸的順序來判斷蛋白質(zhì)的C端序列。其中釋放氨基酸的檢測有兩種：（1）色譜法：直接檢測所釋放的氨基酸；（2）質(zhì)譜法：通過測定蛋白質(zhì)或多肽原分子量和釋放一個氨基酸以后分子量的差值來推斷所釋放氨基酸種類，依次類推。羧肽酶法是近年來一種應(yīng)用廣泛的蛋白質(zhì)及多肽C端測序方法。羧肽酶有4種，即: 羧肽酶A（CPA）、羧肽酶B（CPB）、羧肽酶Y（CPY）和羧肽酶P（CPP）。其中常用的是CPY和CPP。  

（2）化學(xué)法：化學(xué)法指蛋白質(zhì)或多肽與化學(xué)試劑反應(yīng)后，專一性的裂解并檢測C端氨基酸的方法。主要有(異) 硫氰酸法和過氟酸酐法。

1、 (異)硫氰酸法的原理：(異)硫氰酸法又稱Schlack-Kumpf降解,該方法與Edman降解的原理類似.即化學(xué)試劑（異)硫氰酸）與蛋白或多肽的α-羧基反應(yīng)，形成蛋白質(zhì)或多肽乙內(nèi)酰硫脲,再用裂解試劑切下C端殘基,形成氨基酸乙內(nèi)酰酸脲,然后利用HPLC系統(tǒng)分離分析游離的氨基酸乙內(nèi)酰酸脲。由于不同氨基酸的乙內(nèi)酰酸脲在HPLC上的保留時間不同，因此可以區(qū)分各種氨基酸。C端測序儀的原理即(異) 硫氰酸法。

2、過氟酸酐法的原理：C端氨基酸殘基的α-羧基與混合酸酐反應(yīng)后，通過酮-烯醇轉(zhuǎn)換成氧氮雜環(huán)戊酮（惡唑酮），然后利用過氟酸或TFA，把這個環(huán)從C端截掉。然后反應(yīng)依次連續(xù)進行。用質(zhì)譜測定反應(yīng)產(chǎn)物的分子量，通過相鄰分子量的差值就可以得到其C端序列。  另外質(zhì)譜法在蛋白質(zhì)測序中發(fā)揮的作用越來越大。    

Edman降解（Edmandegradation）：是測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的方法，主要是從蛋白質(zhì)或多肽氨基末端進行分析。由埃德曼（P．Edman）在上世紀(jì)50年代所創(chuàng)立。分為耦合、切割、萃取、轉(zhuǎn)化、鑒定等幾個步驟。首先在pH9．0的堿性環(huán)境下，將異硫氰酸苯酯(Ph—N=C=S，PITC)和蛋白質(zhì)或多肽N端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物；然后以耦合后產(chǎn)物，將多肽或蛋白的N一端*個肽鍵選擇性的切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物：隨后萃取出釋放的氨基酸衍生物并在強酸性條件下轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸(PTH．氨基酸)；后以色譜法鑒定出降解下來的PTH．氨基酸種類，從而得到蛋白質(zhì)或多肽N端序列信息。Edman降解法的優(yōu)點是異硫氰酸苯酯與所有氨基酸殘基的反應(yīng)產(chǎn)率和回收率都相當(dāng)高，因此反應(yīng)副產(chǎn)物少，用色譜可以準(zhǔn)確鑒定。而且對大多數(shù)氨基酸殘基而言，30 min的耦合反應(yīng)時間、5 min的切割反應(yīng)時間都已足夠。  DNS法及聚酰胺薄膜層析技術(shù)測定蛋白質(zhì)N—末端和蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析  原理： DNS—Cl在堿性環(huán)境里蛋白質(zhì)和肽的α-氨基酸的氨基起反應(yīng)，生成帶有熒光的、穩(wěn)定的DNS-氨基酸  蛋白質(zhì)在水解前與DNS—Cl反應(yīng)，產(chǎn)生DNS-蛋白質(zhì)，它標(biāo)記在N-末端氨基酸殘基上，經(jīng)水解和薄層層析而測知是何種氨基酸。蛋白質(zhì)水解后與DNS—Cl反應(yīng)，標(biāo)記的是蛋白質(zhì)的氨基酸組成成分，如圖19-1和圖19-2所示。這是一種較為簡便的、適用的蛋白質(zhì)的氨基酸組成成分分析的方法。（薄層層析：英文為thin layer chromatography 又稱薄層色譜，色譜法中的一種，是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種重要實驗技術(shù)，屬固—液吸附色譜，兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點，一方面適用于少量樣品（幾到幾微克，甚0.01微克）的分離；另一方面在制作薄層板時，把吸附層加厚加大，因此，又可用來精制樣品，此法特別適用于揮發(fā)性較小或較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的質(zhì)。是將吸附劑、載體或其他活性物質(zhì)均勻涂鋪在平面板（如玻璃板、塑料片、金屬片等）上，形成薄層（常用厚度為0.25毫米左右）后，在此薄層上進行層析分離的分析方法。

酶的不可逆抑制是指酶抑制劑與酶的活性中心發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)抑制劑共價地連接在酶分子的必需基團上，阻礙了底物的結(jié)合或破壞了酶的催化基團。這種抑制不能用透析或稀釋的方法使酶恢復(fù)活性。   通常將其分為非專一性不可逆抑制劑和專一性不可逆抑制劑。  抑制劑與酶分子上不同類型的基團都能發(fā)生化學(xué)修飾反應(yīng)，這類抑制稱為非專一性的不可逆抑制。雖然缺乏基團專一性，但在一定條件下，也有助于鑒別酶分子上的必需基團。由于非專一性的不可逆抑制劑通常可作用于酶分子中的幾類基團。但不同基團與抑制劑的反應(yīng)性不同，故某一類基團常首先或主要地受到修飾。如被修飾的基團中包括必需基團，則可導(dǎo)致酶的不可逆抑制。隨著蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和功能的研究，目前已發(fā)現(xiàn)或合成了氨基酸側(cè)鏈基團的修飾劑。
這些化學(xué)試劑主要作用于某類特定的側(cè)鏈基團，如氨基、巰基、胍基和酚基等。但絕大多數(shù)試劑都不是專一性的，可借副反應(yīng)而同時修飾其他類型的基團。   專一性的不可逆抑制作用有KS型和Kcat型兩類。KS型不可逆抑制又稱親和標(biāo)記試劑，結(jié)構(gòu)與底物類似，但同時攜帶一個活潑的化學(xué)基團，對酶分子必需基團的某個側(cè)鏈進行共價修飾，從而抑制活性。Kcat型不可逆抑制劑又稱酶的自殺性底物。這類抑制劑也是底物的類似物，但其結(jié)構(gòu)中潛在著一種活性基團，在酶的作用下，潛在的化學(xué)活性基團被激活，與酶的活性中心發(fā)生共價結(jié)合，不能再分解，酶因此失活。  

KS型不可逆抑制劑是根據(jù)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計的： 1、它具有和底物類似的結(jié)構(gòu)， 2、可以和靶酶結(jié)合，  3、同時還帶有一個活潑的化學(xué)基團可以和靶酶分子中的必需基團起反應(yīng)， 4、該活潑化學(xué)基團能對靶酶的必需基團進行化學(xué)修飾，從而抑制酶的活性。   鹵酮是使用早也是經(jīng)典的親和標(biāo)記試劑。其中以溴酮及氯酮較佳。例：胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶是兩種專一性不同的內(nèi)肽酶，分別水解堿性氨基酸或芳香氨基酸的 羧基所形成的肽鍵，也可以分別水解這兩類氨基酸的酯類，但其氨基酸必須被阻斷而成非游離狀態(tài)。   Kcat型不可逆抑制劑即酶的自殺性底物，也是底物的類似物，但其結(jié)構(gòu)中潛在著一種活性基團，在酶的作用下被激活，與酶的活性中心發(fā)生共價結(jié)合，使酶失活。每一種自殺底物都是酶的作用對象，這是一種專一性很高的不可逆抑制劑。

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