植物類胡蘿卜素含量檢測試劑盒說明書

微量法

貨號: BC4335

規(guī)格: 100T/96S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

提取液：自備80%丙 酮，將丙 酮：蒸餾水（V:V）=4:1混合待用，提供一個125mL空瓶。

產品簡介：

類胡蘿卜素(carotenoid)是一類重要的天然色素的總稱，普遍存在于動物、高等植物、真菌、藻類的黃色、橙紅色或紅色的色素之中。類胡蘿卜素是體內維生素A的前體，同時還具有抗氧化、免疫調節(jié)、抗癌、減輕心血管疾病及著色劑等作用。

植物的類胡蘿卜素存在于各種黃色質體或有色質體內；如黃葉，黃色花卉，黃色和紅色的果實和黃色塊根等組織，樣本通過溶劑萃取，分離提取類胡蘿卜素，在440±10nm處有特殊吸收峰。

大部分高等植物和藻類微生物的葉綠體內也含有類胡蘿卜素，類胡蘿卜素主要吸收藍紫光，而葉綠素a和葉綠素b既吸收紅光又可吸收藍紫光。所以針對含葉綠體的組織，為排除葉綠素a和葉綠素b對類胡蘿卜素的干擾，根據經驗公式先計算出葉綠素a和葉綠素b的含量，再進一步得出類胡蘿卜素的含量；針對不含葉綠素的組織可以直接根據類胡蘿卜素的經驗消光系數進行計算。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、微量玻璃比色皿/96孔板（非聚苯乙烯材質）、天平、可調式移液槍、研缽/勻漿器、10 mL離心管/試管、蒸餾水和丙 酮。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、新鮮植物葉片（去掉中脈）或其他組織用蒸餾水洗干凈，然后吸干表面水分，稱取約0.1g，剪碎放入研缽或勻漿器中。

2、加入1mL蒸餾水，少量試劑一（約10mg），在黑暗或弱光條件下充分研磨，轉入10mL離心管或試管中。

3、用提取液沖洗研缽或勻漿器，將所有沖洗液轉入10mL離心管或試管中，用提取液定容至10mL，置于黑暗條件或者包上錫箔紙浸提3h（期間可以顛倒混合2次），觀察底部組織殘渣接近于白色則提取全，若組織殘渣未全變白，繼續(xù)浸提至組織殘渣顏色接近于白色。

二、測定步驟

A、黃色或其他非綠色組織（不含葉綠體）類胡蘿卜素含量測定步驟：

1、分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至440nm，分光光度計用提取液調零。

2、樣本檢測（微量玻璃比色皿檢測不用測空白管，用96孔板檢測空白管只需檢測1-2次）

B、新鮮植物葉片或其他綠色組織（含葉綠體）類胡蘿卜素含量測定步驟：

1、 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)多波長至470nm、646nm和663nm，分光光度計用提取液調零。

2、 樣本檢測（微量玻璃比色皿檢測不用測空白管，用96孔板檢測空白管只需檢測1-2次）

注意：若上層浸提液有殘渣，可吸取1mL上層浸提液置于1.5mL棕色EP管，常溫下4000r/min離心5min，再取上清液檢測；若使用聚苯乙烯材質的96孔板，請在加樣后5min內盡快測定完成。

三、類胡蘿卜素含量的計算

A、黃色或其他非綠色組織（不含葉綠體）類胡蘿卜素含量的計算公式：

1、按微量玻璃比色皿計算

類胡蘿卜素含量（mg/g 質量）=A₄₄₀÷（ε×d）×V 樣總×1000÷W×F=0.04×A₄₄₀×F÷W

V 樣總：提取液總體積，0.01L；1000：單位換算系數，1g=1000mg；ε：類胡蘿卜素經驗消光系數，250L/g/cm；d：比色皿光徑，1cm；F：稀釋倍數；W：樣本質量，g。

2、按96孔板計算

類胡蘿卜素含量（mg/g 質量）=ΔA₄₄₀÷（ε×d）×V 樣總×1000÷W×F=0.067×ΔA₄₄₀×F÷W

V 樣總：提取液總體積，0.01L；1000：單位換算系數，1g=1000mg；ε：類胡蘿卜素經驗消光系數，250L/g/cm；d：96孔板光徑，0.6cm；F：稀釋倍數；W：樣本質量，g。

B、新鮮植物葉片或其他綠色組織（含葉綠體）類胡蘿卜素含量的計算公式：

1、按微量玻璃比色皿計算

C_a（mg/L）=12.21×A₆₆₃-2.81×A₆₄₆

C_b（mg/L）=20.13×A₆₄₆-5.03×A₆₆₃

類胡蘿卜素濃度：C_c（mg/L）=（1000×A₄₇₀-3.27×C_a-104×C_b）÷229=4.367×A₄₇₀-0.014×C_a-0.454×C_b

類胡蘿卜素含量（mg/g 質量）=C_c×V提取×F÷W=0.01×C_c×F÷W

V提?。禾崛∫后w積，0.01L；F：稀釋倍數；W：樣本質量，g。

2、按96孔板計算：

C_a（mg/L）=（12.21×ΔA₆₆₃-2.81×ΔA₆₄₆）÷0.6 =20.35×ΔA₆₆₃-4.83×ΔA₆₄₆

C_b（mg/L）=（20.13×ΔA₆₄₆-5.03×ΔA₆₆₃）÷0.6 =33.55×ΔA₆₄₆-8.38×ΔA₆₆₃

類胡蘿卜素濃度：C_c（mg/L）=（1000×ΔA₄₇₀÷0.6-3.27×C_a-104×C_b）÷229=7.278×ΔA₄₇₀-0.014×C_a-0.454×C_b

類胡蘿卜素含量（mg/g 質量）=C_c×V提取×F÷W =0.01×C_c×F÷W

V提?。禾崛∫后w積，0.01L；F：稀釋倍數；W：樣本質量，g；0.6：光徑比例，0.6cm（96孔板光徑）：1cm（比色皿光徑）。

注意事項：

1. 若不確定組織中有無葉綠素影響，可取樣本提取液采用分光光度計在波長400-700nm下進行掃描，看波長640-670nm之間有無波峰，有波峰則為有葉綠素，反之則無。

2. 若使用聚苯乙烯材質的96孔板，請在加樣后5min內盡快測定完成。

3. 當A超過1時，建議將樣本用提取液稀釋后再進行測定，計算公式中乘以稀釋倍數F。

4. 為了避免色素見光分解，操作時應盡量避光，研磨或勻漿時應盡量縮短時間。

5. 提取液易揮發(fā)，操作時做好防護措施。

實驗實例：

1. 取0.1g黃色花朵加入1mL蒸餾水、少量試劑一（約10mg），在黑暗或弱光條件下充分研磨，轉入10mL離心管，提取液沖洗研缽或勻漿器，用提取液定容至10mL，置于黑暗條件或者包上錫箔紙浸提3h（期間可以顛倒混合2次），按照操作步驟A，用96孔板測定并計算ΔA₄₄₀=A₄₄₀測定管-A₄₄₀空白管=0.202-0.045=0.157，計算含量得：

類胡蘿卜素含量（mg/g 質量）=0.067×A₄₄₀÷W=0.1052 mg/g 質量。 

2. 取0.1g綠蘿葉片加入1mL蒸餾水、少量試劑一（約10 mg），在黑暗或弱光條件下充分研磨，轉入10 mL離心管，提取液沖洗研缽或勻漿器，用提取液定容至10 mL，置于黑暗條件或者包上錫箔紙浸提3 h（期間可以顛倒混合2次），按照操作步驟B，用96孔板測定并計算ΔA₄₇₀=A₄₇₀測定管-A₄₇₀空白管=0.415-0.043=0.372、ΔA₆₄₆=A₆₄₆測定管-A₆₄₆空白管=0.189-0.042=0.147、ΔA₆₆₃=A₆₆₃測定管-A₆₆₃空白管=0.379-0.042=0.337。計算含量得：

C_a（mg/L）=20.35×0.337-4.83×0.147=6.145 mg/L；

C_b（mg/L）=33.55×0.147-8.38×0.337=2.108 mg/L；

C_c（mg/L）=7.278×ΔA₄₇₀-0.014×C_a-0.454×C_b=1.662 mg/L；計算含量得：

類胡蘿卜素含量（mg/g 質量）=0.01×C_c×F÷W =0.1662 mg/g 質量。

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